Tisztelt Kérdező!

CD4 es a CD8 csak a helper és suppressor sejtek arányát mutatja, funkcióját nem.
Az egyik, egyszerű módszer:a neopterin mérése. Ezzel egyértelmű eredményt értünk el.
A neopterint 1967-ben Sakurai és Goto izolálta először daganatos betegek vizeletéből [1]. 1983-ban Huber és munkatársai megvizsgálták, milyen stimuláló faktorok hatására termelődik a sejtekben a neopterin. T-, B-, ill. macrophag sejtekhez adtak allogén sejteket, módosított autológ sejteket ill. mitogéneket. Azt találták, hogy mindhárom esetben van a T-sejt aktiváció mértékével arányos neopterin termelés, de nem a T-sejtek termelik, hanem az azokból felszabaduló anyagok hatására valamelyik másik sejt [2]. 1984-ben szintén Huber és munkacsoportja további vizsgálatokkal bebizonyíották, hogy valamennyi perifériás vérsejt közül egyedül a macrophagok termelnek neopterint. Macrophag-tenyészethez különböző, T-lymphocyták által termelt és potenciális induktornak gondolt anyagot (zymosan, forbol-myristat-acetát, CSF, IFN-γ) adtak eltérő koncentrációban és különböző ideig hagyták hatni azokat. Kiderült, hogy egy igazán hatásos induktora van a neopterin elválasztásának ez pedig az aktivált T-sejtek által szekretált IFN-γ [3,4]. Ezt támasztja alá az, hogy IFN-γ ellenes antitest adása szupprimálta a neopterin termelődését [3]. Az IFN-γ hatására a macro-phagokban megnövekszik a GTP szint, ami fokozza a GTP-CH I. aktivitását, így neopterinszintézist indukál. Ezenkívül fokozza a macrophagok antimicrobialis aktivitását és oxidatív metabolizmusát [5].
A neopterin a pterin-azon belül pteridin – csoportba tartozó, biciklikus, nitrogéntartalmú gyűrűt tartalmazó vegyület, pyrazino (2,3,d) primidin. Szintézisének kiinduló vegyülete a GTP. Ebből a GTP-CH I. hatására, majd egy amadori-reakciónak nevezett lépésen át 7,8-NH2-TP keletkezik. (1.ábra) [6,7]. Ez a vegyület olyan sejtekben, melyek PBH4.S enzimet tartalmaznak, továbbalakul 5,6,7,8-BH4-é majd több lépésen át triptofánná és a dopamin, noradrenalin ill. szerotonin-szintézisben játszik szerepet. A humán macrophagokban ez az enzim hiányzik, így-valószínűleg nem enzimatikus úton – a 7,8 NH2-TP két lépésben neopterinné lakul. A termelődött neopterin felhalmozódik, exkrécióra kerül és a szérumban megjelenik, mértéke arányos a GTP-CH I. enzim aktiválódásával, ill. az aktivált T-lymphocyták által kibocsájtott IFN-γ mennyiségével (2. ábra). A neopterin katabolizmusa még pontosan nem tisztázott, de ami biztos, hogy eredeti formában is ürül vesén keresztül, így vizeletből is meghatározható – azonban emiatt a vesefunkciótól is függ az ürített mennyiség, ezért vizeletből történő meghatározás esetén figyelemben kell venni a clearance értékét [8,9].
Számos tanulmány bebizonyította, hogy egyes lymphocyta aktivációval kísért kórképek – pl. fertőző megbetegedések, SLE, rheumatoid arthritis, Crohn-betegség, BG-kór, Hashimoto thyreoditis esetén a neopterin koncentrációja a szérumban emelkedik, illetve jelzi a betegség aktivitását valamint utalhat a pajzsmirigybetegség malignus eredetére [10,11,12,13,14,15].

Betegek és módszerek

2005 januárja és 2011 márciusa között 137 BG-kórban, 25 Hashimoto thyreoditisben, 14 toxikus adenomában szenvedő nőbetegben határoztuk meg a szérum neopterin szinteket. A BG-kóros betegeket öt, az alábbiakban részletezett csoportba osztottuk. 47 beteg frissen felfedezett hyperthyreosisos, 36 beteg három-hat hónapja methimazol kezelésben részesülő euthyreosisos, 7 beteg hypothyreosisos volt. 34 beteg egyéves thyreostaticum kezelést követő második évben euthyreosisos volt, míg 13 beteg methimazol kezelés elhagyását követően recidív hyperthyreosisban szenvedett. A BG-kór diagnózisát az anamnézis, a klinikai tünetek, az ultrahanggal igazolt hypoechogén struma, a TSH-receptor elleni antitest pozitivitás, a diffúz radioizotóp felvétel biztosította. Hashimoto thyreoiditises betegeink szubsztitúcióval euthyreosisosak voltak, kis (10 ml alatti), echoszegény pajzsmirigy mellett Tg és/vagy TPO –elleni antitest pozitívak voltak. A 137 BG-kóros betegből 61 esetben alakultak ki a társuló Graves orbitopathia, (GO) tünetei. A GO súlyossági fokának megállapításakor a NOSPECS beosztást vettük alapul [16]. A GO-s betegeket súlyossági fokuktól függően 2 csoportra osztottuk, a 2b, c,, ill. ennél magasabb fokozatúakat az infiltratív csoportba, az 1, ill. 2a tüneteket mutatókat a nem infiltratív csoportba osztottuk.
A szabad pajzsmirigyhormonok és TSH meghatározása LIA-MAT kitekkel (Byk-Sangtec luminométer) történtek. A normáltartományok a következők voltak: fT4:7,72-23,1 pmol/l. fT3: 3,4-7,1 pmol/l, TSH: 0,3-3 mU/l.
A TSH –receptor elleni antitest méréséhez radioreceptor, módszert (DYNOtest TRAK human, Brahms) alkalmaztuk. Pozitívnak tekintettük az eredményt, ha 2 U/l felette értéket mértünk.
A thyreoglobulin-elleni és a pajzsmirigyperoxidáz-elleni antitestek meghatározása ELISA módszerrel történt [17]. Az eredményt ELISA indexben értékeltük, melyet úgy kaptunk, hogy a betegek savójának O.D. értékét osztottuk a kontroll O.D. értékkel. Pozitívnak tekintettük, ha az index meghaladta a kontroll +2 SD értékét.
A neopterin meghatározás ELISA módszerrel (Neopterin ELISA, Merck kit) történt. Mivel a neopterin fényérzékeny és hosszú ideig nem tárolható, a mintákat a mérésig 2-8 Celsius fokon sötét helyen tároltuk, és a méréseket is fénytől védett helyen végeztük. A kit tartalmazta az előre elkészített reagenseket, standard oldatokat és a Stop-oldatot.
A mérések során a mintákhoz adtuk a reagenseket, majd szobahőmérsékleten inkubáltuk 90 percig. Ezután mosás, majd még 10 perc inkubálás következett. A Stop-reagenssel leállítottuk a reakciót, mely végsősoron egy sárga színű mintát eredményezett. Ennek a mintának a 450 nm-en mért abszorbanciája arányos volt a benne lévő neopterin mennyiségével. Ezt az abszorbanciát ELX 800 ELISA reader (BI-TEK Instruments INC) készülék segítéségével olvastuk le.
A neopterin normál tartományának a kontrollcsoport értékeit vettük. Az intra-ill. interassay CV 8,9- ill14,9% volt. Kontrollként azonos korcsoportú jó vesefunkciójú 42 egészséges egyén szolgált, valamennyien nők, életkoruk 44,1+- 12,9 év volt. Mindannyian biokémiai paraméterekkel igazoltan euthyreosisosak, pajzsmirigy elleni antitest negatívak voltak, tapintható strumájuk nem volt. Lezajlott vagy éppen zajló vírusos betegségük a vérvételt megelőző hónapban nem volt.
A statisztikai számítást a Windows Microsoft Excel statisztikai programjával (kétmintás t-próba, korreláció számítás) végeztük. Az egyes csoportok értékeit átlag +- SD formában adtuk meg, statisztikai szignifikanciát p< 0,05 esetén állapítottunk meg.

Eredmények

Az egyes betegcsoportokat, a betegek átlagos életkorát, pajzsmirigyfunkciós paramétereit (fT4, fT3, TSH) és az egyes csoportokban az átlagos neopterin értékeket a 1. táblázatban tüntettük fel. A neopterin és TRAb szintek statisztikai jellemzőinek összehasonlítása a 2. táblázatban látható. Korrelációt találtunk az egészséges kontrollok életkora és a szérum neopterin szintje között (r = 0,61 p<0,001), tehát a neopterin szérumszintje az életkorral párhuzamosan emelkedett.
Szignifikánsan magasabb neopterin értékeket találtunk BG-kóros betegeinkben mind hyper-(9,87±2,08 vs. 7,77±2,65, p<0,01), mind euthyrosisban (9,76±3,75 vs 7,77±2,65 p<0,01) vagy thyreostaticum indukálta hypothyreosisban (9,56±2,2 vs.7,77 nmol/l, p<0,01), valamint recidív hyperthyreosisban (9,56±2,2 vs. 7,77±2,65 nmol/l, p<0,01). Hasonlóan statisztikailag magasabb neopterin értékek jellemezték Hashimoto thyreoiditises betegeinket (10,94±2,8 vs. 7,77±2,65 nmol/l, p<0,001). A gyógyultnak tartott, euthyreosisossá vált, már kezeletlen egyének és a hyperfunkciós, toxikus adenomás betegek neopterin értéke jelentősen nem tért el a kontrollcsoportétól (8,07±3,38 ill. 8,12±3,0 vs. 7,77±2,65 nmol/l).
Nem volt statisztikailag szignifikáns különbség, ha BG-kóros betegeink szérum neopterin szintjeit a GO–s és nem GO-os betegekben hasonlítottuk össze. (9,63±1,98 vs.9,4±2,12nmol/l) Pozitív korreláció (r=0,58, ill. 0,65, p<0,05) volt megfigyelhető a neopterin és a Tg elleni, valamint a TPO elleni antitestek szintek között valamennyi betegcsoportban. Nem találtunk összefüggést a neopterin szintek változása és a pajzsmirigyhormonok, a TSH ill. a TRAb értékek között sem a kontroll, sem a betegcsoportokban.
Összehasonlítva a különböző betegcsoportokban mért neopterin és TRAK szintek esetében a szenzitivitást, a specificitást és a pozitív prediktiv értékeket arra az eredményre jutottunk, hogy a neopterin statisztikai jellemzői csak magas, 13 nmol/l feletti (az átlagot több, mint 2SD-vel meghaladó) koncentrációk esetén közelítenek a TRAK-éhoz (szenzitivitás 0,18 s. 1,0, specificitás 0,87 vs 0,94, pozitív prediktiv érték 0,64 vs. 0,96). Ilyen magas neopterin értékeket azonban a csoportokban 40% alatti gyakorisággal mértünk.


Megbeszélés

Számos tanulmány emelkedett neopterin exkréciót igazolt vírusinfekciók, egyes intracelluláris bakteriális és protozoon fertőzések, rheumatoid arthritis, SLE, akut graft kilökődés, HIV, Crohn-betegség és autoimmun pajzsmirigybetegségek esetén. Ezen kórképek többségében a neopterin szintjének emelkedése rendszerint megelőzte a klinikai manifesztációt, a betegség aktivitásával arányosan változott a szintje, vagyis bizonyos betegségekben az immunrendszer aktivitását hatásosan jelezte [11,12,18,19,20,21].
Korábbi vizsgálatainkban az találtuk, hogy a szolubilis IL-2 receptor (sIL-2R) és a szolubilis CD8 szint lényegesen emelkedett a BG-kóros betegekben és jelzője a betegség kiújulásának [22]. Jelen vizsgálatainkban arra a kérdésre kerestünk választ, hogy autoimmun pajzsmirigybetegekben a neopterin szintek összefüggenek-e a betegség klinikai stádiumaival, előre jelezheti-e a neopterin a betegség recidiváját, tehát alkalmas-e az immunológiai monitorozásra.Pozitív korrelációt találtunk az életkor és a szérum neopterin értéke között egészséges egyénekben, ami megegyezik az irodalmi adatokkal [23]. Magasabb átlagos neopterin értékeket találtunk BG-kóros és Hashimoto thyreoditises betegekben az egészséges kontrollokhoz viszonyítva. Ez jelenség háttérben zajló autoimmun folyamattal állhat összefüggésben. Ezt támasztja alá az is, hogy a neopterin értékek nem mutattak összefüggést a pajzsmirigyhormonok változásával, mivel toxikus adenomás betegekben nem volt magasabb a neopterin szint. Eredményeink alapján felmerült, hogy a magasabb neopterin szint jelezheti a betegség recidíváját, hiszen recidív hyperthyreosisban szignifikánsan magasabb érték volt mérhető, mely már nem korrelált sem az életkorral, sem a pajzsmirigyhormonok koncentrációjával, tehát az autoimmun folyamat fellángolását jelezte. Nem találtunk azonban összefüggést a neopterin és a TSH receptor elleni antitestek titere között, melynek emelkedett szintje elfogadottan előrejelzi a betegség recidíváját, ill. a betegség patofiziológiai alapját is jelenti. Az átlagos értéket több mint 2SD-vel meghaladó (13 nmol/l) feletti) neopterin érték mellett a statisztikai jellemzők közelítik ugyan a TRAb statisztikai információtartalmát, de a 13 nmol/l feletti neopterin koncentrációt egyik vizsgált csoportban sem mértünk 40%-os gyakoriság felett. Ez a látszólagos ellentmondás azzal magyarázható, hogy a TRAK nem csak a stimuláló, hanem a blokkoló típusú TSH- receptor elleni antitestek szintjét is jelzi. A vizsgálatok eredményei alapján megállapítható, hogy a neopterin meghatározása fontos jelzője lehet az autoimmun pajzsmirigybetegségek recidivájának .
Irodalom

[1] Abbas, A.K., Lichtmann, A.H., Pober, J.S.: Cellular and molecular immunology. Fourth edition. W.B. saunders Company, 2000, 404-424
[2] Hueber, C., Fuchs, D., Hausen, A., et al.: Pteridines as a new marker to detect human T cell activated by allogenic or modified self major histocompability complex (MHC) determinants. J. Immunol., 1983,130, 1047-1050.
[3] Hueber, C., Batchelor, J,R., Fuchs, D., et al: Immune response associated production of neopterin. Release from macrophages primarily under control of interferon-gamma. J. Exp. Med., 1984, 160, 310-316.
[4] Nathan, C.F., Murray, H.W, Wiebe M.E, et al.: Identification of interferon gamma as the lymphokine that ectivates human acrophage oxidative metabolism and antimicrobal activity. J. Exp. Med., 1983,158,670-689.
[5] Roitt, I.: Essential immunology. Blackwelle Wissenschafts-Verlang GmbH. 1977,401-405.
[6] Duch, D.S., Bowers, S.W., Woelf, J.H., et al.: Biopterin csofactor biosyntethesis: GTP cyclohydrolase neopterin and biopterin in tissues and body fluids of mammalian species. Life Sci., 1984,35,1895-1901.
[7] Nicol, C.A., Smith, G., Duch, D.: Biosyntheses and metabolism of tetrahydrobiopterin adt molybdopterin, Annu. Rev. Biochem, 1986,54, 729-764.
[8] Schoedon, G., Troppmair, J., Fontana, A., et al.: Biosynthesis and metabolism of pterins in perpheral blood mononuclear cells and leukaemia lines of man and mouse. Eur. J. Biochem., 1987,166,303-310.
[9] Werner, E., Bichler, A.., Daxenbichler, G.,et al: Determination of neopterin in serum and urine. Clin. Chem. 1978, 33, 62-66.
[10] Murr, C., Neurauter, G., Wirleitner, B., et al.: Neopterin to predict prognosis of infection and neoplasia, International EUROGIN-EAST conference, Vilnius 8-10 september 2001, http://www.tmi.vu.lt/legacy/eurogin-east/neopterin.htm
[11] Lim, K.L., Muir, K., Powell, R.J.: Urine neopterin: a new parameter for serial monitoring of disease activity in patients with systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis. 1994, 53, 743-748.

Jó egészséget kívánok:

Prof. Dr. Balázs Csaba
2017-01-24 08:40:42