Tisztelt Gabriella!
További információk:
Basedow-Graves kórban a TSH-receptor elleni antitesteknek a kórfolyamat kialakulásában és a betegség diagnózisában meghatározó szerepük van. A vizsgálat célja: egy kompetitív humán radioreceptor és két enzimjelzéses receptor immunoassay mérési eredményeinek összehasonlítása volt. A szerzők 124 Basedow-Graves kóros beteg (103 nő, átlagéletkor 41,4 ± 9,5 év és 21 férfi átlagéletkor 47±13 év) szérumában határozták meg a TSH-R elleni antitestek szintjét radioimmunoassay (humán rekombináns TSH-receptort tartalmazó rhTSH-R DYNOR TRAK) és két enzim-jelzéses (sertés TSH-receptort tartalmazó IASONTRAb és DLD) kitek segítségével. A kontroll csoportot 25 egészséges önkéntes (23 nő és 2 férfi, átlagéletkor 39±15 év) alkotta. Mindkét enzimjelzéses kit eredményei jól korreláltak az izotópos módszerrel. A két módszer közül a IASONTRAb kit jobb korrelációt mutatott, mint a DLD kit (r=0,817, p<0,001 v.s. r = 0,792, p<0,001). 124 beteg savójából 121 TRAK pozitívnak bizonyult, 86 esetben pedig mindhárom tesztben pozitivitást észleltek. Az ELISA módszerek specificitása a DYNO teszt értékeihez viszonyítva a IASONTRAb-nál 60,6 % és a DLD-nél 50,9 %, a szenzitivitás a IASONTRAb-nál 92,7 % a DLD-nél pedig 90,9 % volt. 25 Basedow-Graves kóros betegben (24 nő, átlagéletkor 42 ± 12 év) a gyógyszeres kezelés után a TSH-receptor elleni antitestek negatívvá váltak. A kezelés elhagyása után 11 betegben a TSH-receptor elleni autoantitestek szintje megemelkedett és a hyperthyreosis klinikai és laboratóriumi jeleit észlelték. A kompetitív radioreceptor és az enzimjelzéses módszerek hasonló szenzitivitása és specificitása miatt az izotóp-jelzéses technika helyettesítésére az enzim-jelzéses módszerek alkalmasak, és jelezhetik a betegség recidíváját. E módszerek előnye, hogy felhasználásuk nincs szűk lejárati időhöz kötve és kiküszöbölik a TSH elleni antitestek és az állati fehérjék (egér) elleni antitestek jelenléte miatti hibákat.
A Basedow-Graves (B-G) kórban jelentkező hyperthyreosis létrejöttéért és fenntartásáért autoimmun mechanizmus felelős. A hyperthyreosis kialakulásában a TSH-receptor (TSH-R) elleni stimuláló típusú TSH-R elleni autoantitesteknek tulajdonítanak patogenetikai szerepet (2,3,5,6,8,9). A TSH-R a TSH molekula természetes kötőhelye, amely a G-proteinnel kapcsolt, 7 hidrofób transzmembránszegmentumot tartalmazó receptorcsaládba tartozik. Míg ennek a receptorcsaládnak a klasszikus képviselői (az alfa-, béta adrenerg-, dopamin receptorok) rövid N-terminális extracelluláris doménnel rendelkeznek, addig a TSH- és a vele rokon luteinizáló (LH)-, humán choriogonadotrop (hCG) hormonreceptoroknak nagy extracelluláris doménjük van. A TSH-R 764 aminosavból áll és a molekulasúlya 84.5 kD. Az N-terminális extracelluláris domén (A vagy α alegység) 394 aminosavat és 6 glikozilációs helyet foglal magában. Ez a régió 5 doménre (E1-E5) tagolódik és nagyfokú homológiát mutat az LH és a hCG receptorokkal. A TSH-R másik ún. B vagy β alegysége egyaránt tartalmaz intramembranális és intracelluláris részeket. A membránban levő szakasz 266 aminosavból áll, az intracelluláris hurok első tagja nagyon konzervatív felépítésű, a harmadik viszont csak a TSH-R-ra jellemző. Az intracelluláris rész 83 aminosavból áll és bázikus vegyhatású. A TSH receptornak két olyan szakasza van, amely semmiféle homológiát nem mutat más receptorokkal (38-45 és 317-366 közötti szakaszok). A receptorban lévő, leucinban gazdag részek biztosítják az amfipatikus béta-redő struktúrát (4, 5, 6, 13)(1. ábra). Elegáns módszerekkel igazolták, hogy az autoantitestek a TSH-R ektodoménhez kötődnek (4, 15). A TSH-R elleni antitestek funkciójuk szerint stimuláló, blokkoló és neutrális autoantitestek lehetnek. A stimuláló autoantitestek felelősek a hyperthyreosis kialakulásáért. A blokkoló antitestek sztérikus gátlással a TSH-R aktiválását akadályozzák meg és hypothyreosist okoznak. Jelenlétüket kimutatták juvenilis krónikus autoimmun thyroiditisben szenvedő betegekben, főleg a súlyos hypothyreozissal járó formákban (7). A neutrális antitestek létezését csak az utóbbi időben bizonyították, eddigi ismereteink szerint kicsiny affinitásúak és szabályozó funkciót tölthetnek be (5,12). A kísérletek azt mutatták, hogy a B-G kóros betegek savójában mind a három típusú TSH-R elleni autoantitestek egy időben detektálhatók és az eltérő funkciójú antitestek hatásainak vektora eredményezi, hogy adott időpontban a TSH-R elleni antitestek hyperthyreosist vagy hypothyreosist okoznak (5,15,16,18). A TSH-R elleni antitestek kimutatásának több módszerét fejlesztették ki az elmúlt évtizedekben. Korábban kísérleti körülmények között a pajzsmirigy és a polimorfonukleáris granulocyták membránjait használták a TSH-R elleni antitestek kimutatására (15). Mivel ezek a módszerek meglehetősen időigényesek és nehezen voltak standardizálhatóak, ezért a gyakorlatban a radio-receptor kompetitív módszer (TRAK, Brahms, Berlin, Germany) terjedt el (12,18). A módszernek több hátránya van, ezek közül a legfontosabbak, hogy alkalmazása izotóp laboratóriumhoz kötött, a meghatározás időpontját az izotóp lebontásának ideje behatárolja, másrészt a TSH elleni antitestek mellett más (pl. egér elleni) antitestek esetleges jelenléte is befolyásolhatják az eredményt (17). Ezért szükség volt nem izotópos módszerek kifejlesztése, amelyek közül az enzimjelzéses technikák (IASONTRAb és a DLD tesztek) alkalmazhatóságát vizsgáltuk.
Betegek és módszerek
A vizsgálatba 124 BG kóros beteg (103 nő és 21 férfi, átlagéletkor 47 ± 13 év) került. A kontroll csoportot 25 egészséges önkéntes (23 nő és 2 férfi, átlagéletkor 39 ± 15 év) alkotta. A rhTSH-R DYNOR TRAK (Brahms, Germany) a humán TSH receptor (TSH-R) elleni antitestek mennyiségi meghatározására alkalmas módszer. Ennek elve, hogy a küvetták falára kikötött rhTSH-R-hoz 125J-TSH-t adnak, aminek a kötődése vetélkedik a beteg szérumában található TSH-R elleni antitestekkel (2/a. ábra). Standardok (a kikötött TSH-R-t telítő, ismert koncentrációjú szérumok) ismeretében a kikötődött 125J-TSH izotóp aktivitásának mértékéből meghatározható a beteg szérumában található TSH-R elleni antitestek értéke, IU/l egységben kifejezve. A kit megadott diagnosztikus szenzitivitása 98,8%, a specificitása: 99,6%. Az enzimjelzéses meghatározás elvét a 2/b. ábra szemlélteti. A sertés TSH-R-ral bevont csövekhez adjuk a betegek szérumát és az ismert koncentrációjú standard szérumokat, amely szérumokban található TSH-R elleni antitestek vetélkednek a később bemért biotinnal jelzett TSH-val. A TSH-R-hoz kötődött biotin-TSH-hoz streptavidin-peroxidázt kapcsoltak, ami a hozzáadott szubsztráttal (TMB, 3,3’,5,5’ tetra-methyl-benzidin) színreakciót adott. A minták O.D. (optikai denzitás) értékei fotométeres méréssel megadhatók. A standardok kalibrációs görbéje alapján a beteg szérumok TSH-R elleni antitest értéke U/l egységben kiszámolható. Referencia tartomány: <1 IU/l negatív, 1 – 2 IU/l szürke zóna,> 2 IU/l pozitív. Két gyár által készített kétlépcsős enzimjelzéses módszert használtuk: DLD anti–TSH–receptor - (DLD Diagnostika GmbH, Hamburg, Germany) és a IASONTRAbR (IASON Labormedizin GmbH & Co KG, Austria) kiteket. A TSH, fT4, fT3, a Tg- és a TPO-elleni antitestek mérését kemilumineszcens módszerrel (Elecsys 2010, Roche) végeztük (normális tartományok a következők voltak: TSH: 0,27 - 4,2 IU/l, FT4: 0,71 - 1,85 pmol/l, FT3:1,45-3,48 pmol/l, Tg-elleni antitest: 0,5 - 63 IU/l, TPO elleni antitest: 0,5 - 60 IU/l).
Statisztikai módszerek: Az adatok értékelésében a “Stat View” számítóképes programot használtuk (Version 4.5, SAS Institute Corp., North Carolina, USA). Leíró statisztikát, Pearson χ2, Fischer exakt tesztet, ANOVA analízist végeztünk. Szignifikánsnak tekintettük a p 0,05 kisebb értékeket (1).
Eredmények
124 beteg és 25 kontroll savójában határoztuk meg a fentebb említett három módszerrel az autoantitestek titerét. A mérések során az ún. „arany standardnak” a TRAK kittel kapott értékeket tekintettük. Mind a három módszerrel ötször megmértük (kalibráltuk) azokat a savókat, amelyek eltérő TSH-R elleni antitest titerűek voltak (1. táblázat). A kalibrációk során azt figyeltük meg, hogy a vizsgált módszerekben lényeges különbség nem volt. A 124 beteg szérumából 121 beteg savója bizonyult pozitívnak a TRAK módszerrel. Mindkét enzimjelzéses kit eredményei jól korreláltak az izotópos módszerrel (3. ábra). A két módszer közül azonban a IASONTRAb kit mutatott jobb korrelációt, mint a DLD kit (r = 0,817, p<0,001 v.s. r = 0,792, p <0,001). A 121 TRAK pozitívnak bizonyult savóból 86-ban mindhárom tesztben pozitivitást észleltünk (4. ábra). Az ELISA módszerek specificitása a DYNO teszt TRAK értékeihez viszonyítva a IASONTRAb-nál 60,6 % és a DLD-nél 50,9 %, a szenzitivitás a IASONTRAb-nál 92,7 % a DLD-nél pedig 90,9 % volt. 25 B-G kóros betegben (24 nő, átlagéletkor 42 ± 12 év) a gyógyszeres kezelés után a TSH-receptor elleni antitestek negatívvá váltak. A kezelés elhagyása után 11 betegben az autoantitestek szintje megemelkedett és ezt követően a hyperthyreosis klinikai és laboratóriumi jeleit észlelték (5. ábra).
Megbeszélés
Közel 50 éve vált ismertté, hogy BG kórban a hyperthyreosis létrejöttéért egy immunglobulin típusú fehérje (LATS= Long Acting Thyroid Stimulator) a felelős. A LATS-ról később kiderült, hogy az a TSH-R-hoz kötődő antitestekkel azonos (8). Közel három évtizedes erőfeszítések során sikerült egyre használhatóbb módszereket kidolgozni a TSH-R elleni antitestek meghatározására. A kezdetben alkalmazott módszerek lényege az volt, hogy sertés- és/vagy humán pajzsmirigy-sejtmembránt preparáltak, majd ezek szuszpenziójához adták a betegek savóját, centrifugálás, mosás után a radiojóddal jelzett TSH kötődésének mértékéből következtettek a TSH-R elleni antitestek jelenlétére (3,5,11,18). Ezek az úttörő vizsgálatok egyrészt nehéz standardizálhatóságuk, másrészt időigényességük miatt nem voltak alkalmasak a mindennapi diagnosztika céljaira. Az első generációs TRAK kifejlesztése jelentette az áttörést. Ennek lényege, hogy szolubilizált sertés pajzsmirigy membránt állítottak elő és egyfázisú kompetitív radioreceptor teszt segítségével már jól standardizált antitest szinteket lehetett mérni. A 3. évezred kezdetén jelentek meg az ún. kétfázisú módszerek (13,14,18). Ezt az tette lehetővé, hogy a sertés pajzsmirigy membrán helyett humán rekombináns TSH-R-t (hrTSH-R-t) állítottak elő, amelyet adszorbeáltak a felülethez, ehhez kötődött a savók TSH-R elleni antitestje, majd a csövek, ill. lemezek mosása után jelző anyagot (125J-al vagy akridinészterrel jelölt TSH-t) adtak a rendszerhez. A nemzetközi (WHO) standardok segítségével jól reprodukálható és közel 100%-os specificitást és 99,1%-os szenzitivitást sikerült elérni. Ezek a kitek (DYNOtest-TRAK humán és a LUMItest-TRAK) napjainkra széleskörben elterjedtek (20,21,23,24). Mindkét tesztnek azonban vannak hátrányai. Az izotópos módszer egyrészt izotópos mérésekhez alkalmas laboratóriumot igényel és alkalmazásának ideje az izotóp bomlása miatt eléggé szűk keretek közé szorított. A lumineszcens módszer az izotópos módszer hátrányait hivatott kiküszöbölni, széleskörű alkalmazását több egyéb tényező mellett eddig az gátolta, hogy a méréshez külön eszköz, luminométer szükséges. A 3. generációs TSH-R elleni antitest mérésének elve az, hogy az újonnan előállított stimuláló típusú monoklonális antitest (M22) vetélkedik a betegek szérumában lévő TSH-R elleni antitestekkel a hrTSH-R-hoz kötődésben. Ez az új módszer lényegesen jobb, mint a 2. generációs technikák. A „két-lépcsős ELISA” módszereket elsődlegesen azért fejlesztették ki, hogy az izotópos eljárásokkal szemben alternatívát kínáljanak. Jóllehet az általunk vizsgált ELISA lemezeken rhTSH-R helyett tisztított sertés TSH-R található, amely azonban lényegesen nem befolyásolta a vizsgálat eredményességét. Ennek lehetséges magyarázata az, hogy a humán és a sertés pajzsmirigy epitópjai jelentős mértékben egyeznek (2,13). Az ELISA tesztek érzékenysége kisebb a 2. generációs TRAK értékénél, ez a tény azonban a mindennapi gyakorlatban nem feltétlen jelent hátrányt. Ennek egyik magyarázatát azok a legújabb biokémiai vizsgálatok adták, amelyekben a TSH-R kis és nagy affinitású kötőhelyeit vizsgálták (19,20,21,22,23,24). A legérzékenyebb módszerek képesek érzékelni a legkisebb affinitású autoantitestek jelenlétét is. Kiderült azonban, hogy az kis affinitású antitestek egy része ún. „természetes autoantitest”, amelynek patogenetikai és prognosztikai szerepe nem tisztázott. Ezek nem képesek a pajzsmirigy működésének befolyásolására, valószínűleg csak a stimuláló antitestek prekurzorai (17). A természetes IgG típusú autoantitest a genetikailag érzékeny egyedekben alakul át külső hatásra (pl. Yersinia enterocolitica fertőzés) betegséget kiváltó stimuláló antitestté (5,6). Nyomonkövetéses vizsgálataink eredménye is ezt a feltevést látszik megerősíteni, ugyanis az ELISA teszt pozitivitása, illetve az antitest titerének emelkedése a klinikai tünetek fellángolása előtt jelezte a betegség recidíváját. Fontos kiemelni, hogy az előnyök mellett az enzim-jelzéses módszerek kalibrációs görbéi nehezebben reprodukálhatóak, ami azzal magyarázható, hogy ez a metodika különösen érzékeny a paraméterek legkisebb változására is (hőmérséklet, pH, leolvasó érzékenysége).
Összegezve, megállapítható, hogy az enzimjelzéses módszerek alkalmasak a B-G kór gyors és megbízható diagnosztikájában és a betegség recidívájának előrejelzésében, eredményességüket nem befolyásolja TSH elleni- vagy egér elleni antitestek zavaró hatása.




Prof. Dr. Balázs Csaba
2010-04-28 12:12:46

Tisztelt Gabriella!
A Basedow kór a pajzsmirigy autoimmun eredetű betegség, amelynek kialakulásában egy másik antitest: a TSH receptor elleni stimuláló antitest játszik szerepet. Szintén örökletes betegség, amelyre kezdetben a pajzsmirigy jelentős túlműködése, strúma és az esetek 5-10 %-ban gyulladásos szembetegségek jellemzőek. A betegségre jellemző klinikai jelek, panaszok, strúma, a TSH-receptor elleni antitest pozitivitása (régen ezt TRAK-al mértük, ma már korszerűbb módszerek vannak!) alapján a diagnózis megállapítható. Napjainkban ez a betegség már gyógyítható. Hangsúlyozni kell, hogy az alkalmazott gyógyszeres, a pajzsmirigy működését gátló szerek (Metothyrin, Propycil) viszonylag hamar (4-6 hét alatt) képesek normalizálni a túlműködést, de az immunológiai folyamat gyógyulása hosszabb időt vesz igénybe (minimum 1 évet!). Ezért nem elegendő a hormonok szintjének mérés, az immunológiai folyamatok követése is szükséges. A kezelésre nem reagáló esetekben a pajzsmirigy műtéte és izotóp kezelése is indokolt lehet. Fontos tudni, hogy az izotópkezelés fokozhatja a szemtünetek kialakulásának kockázatát!
A szem nem vagy nehezen gyógyuló gyulladásai hátterében pajzsmirigy-betegség állhat. Mivel a szemtünetek megelőzhetik, ill. több hónappal követhetik a pajzsmirigy immunológiai ("autoimmun") megbetegedését, ezért a diagnózis hónapokat késhet, pedig ebben a kórképben a minél előbbi kórisme és kezelés a beteg szeme világának megmentését jelentheti.
A klinikai tünetek egyes betegekben és a betegség különböző stádiumaiban eltérőek lehetnek. Kezdetben domináló a fényérzékenység, fokozott könnyezés, fejfájás, idegentest-érzés, később lép fel a szem körüli duzzanat (ödema), kötőhártya gyulladás, látászavar, homályos, majd kettőslátás. Feltűnő lehet a szem "kidülledése", a szaruhártya károsodása, szemizmok hegesedése. Az első szakaszban dominálóak a gyulladásos tünetek (ún. "nedves szem"), később a gyulladásos tünetek "kiégnek" és már sajnos hegesedéssel járó szimptómák váltják fel.
Mikor gondoljon a beteg pajzsmirigybetegséghez társuló szembetegségre?
Ha nem vagy nehezen befolyásolható fentebb említett panaszok lépnek fel és korábbiakban pajzsmirigybetegség miatt kezelték, ha az allergiásnak tartott szembetegség az addig alkalmazott kezelésre nem javult. A diagnózishoz nem elegendők a hormonális vizsgálatok, hanem szakirányú immuno-endokrin kivizsgálás, részletes speciális immunológiai tesztek és az esetek egy részében CT is szükségesek. Lényeges, hogy a minél korábban elkezdett speciális immunológiai ("immunmoduláns") gyógyszeres, gyakran infúzós kezelés eredményes
Mi tehet a beteg a megelőzés érdekében? A betegség súlyosságát ATA értékben fejezzük ki.
Először is gondoljon mind a háziorvos, a szemészorvos és a beteg erre a lehetőségre. A legfontosabb a dohányzás azonnali elhagyása, mert a betegség kialakulásában és romlásában a cigarettázás meghatározó fontosságú. A USA-ban a betegek kezelését el sem kezdik, amíg a beteg nem hagy fel ezzel a kóros szenvedéllyel. Napjainkban már vannak olyan készítmények, amelyekkel megelőzhető ez a betegség.
Jó egészséget kívánok:

Prof. Dr. Balázs Csaba
2010-04-28 12:08:43